RNR3啟動子調控的紅綠熒光蛋白雙信號發光酵母細胞對化學誘變原的篩選

摘要：目的:構建RNR3啟動子調控的紅綠熒光蛋白雙信號發光酵母細胞,用于快速篩選化學誘變原。方法:用PCR方法YIPlac204TC-NLS-DsRed-Express-2擴增DsRed-Express-2紅色熒光蛋白,將其插入到pGPD載體,構建成GPD啟動子驅動的紅色熒光蛋白酵母報告載體(pGPD-DsRed-Express2),用醋酸鋰方法將其轉化于RNR3啟動子調控的綠色熒光蛋白(yEGFP)發光酵母細胞(W303-1A/RNR3-yEGFP),從而構建成紅、綠熒光蛋白雙信發光酵母細胞。紅色熒光蛋白(DsRed-Express-2)信號可用于校正細胞數和狀態不同對yEGFP發光的影響。用不同誘變原分別作用于該發光酵母細胞,于第0、4、8、12、16和20小時,用黑色96孔酶標板分別測紅、綠熒光蛋白的發光強度,用相對熒光強度(yEGFP/DsRed-Express2)描述誘變原的劑量效應關系。結果:在與DNA發生結合的化合物中,放線菌素D和溴乙錠均呈陰性;在與DNA發生烷基化的化合物中,甲磺酸甲脂(MMS)和瘤可寧呈陽性結果,而絲裂霉素C呈陰性結果;在使DNA發生斷裂的誘變原中,順鉑、博來霉素和福來霉素呈陰性,而4-硝基-N-氧化喹啉(4-NQO)呈陽性結果;在抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原中,5-氟尿嘧啶呈陽性結果,而羥基脲、喜樹堿和阿非迪霉素均呈陰性結果;非基因毒性化合物秋水仙堿、刀豆氨酸和四環素均呈陰性。結論:該重組發光酵母細胞(W303-1A/yEGFP/DsRed-Express2)可作為傳統致突變評價方法的補充,具有快速、方便和高通量特點。