慢病毒介導shRNA沉默大鼠肝BRL-3A細胞PDZK1對膽管側膜Bsep表達的影響

摘要：目的構建大鼠PDZK1基因RNA干擾慢病毒載體,并觀測其對大鼠BRL-3A細胞PDZK1的基因沉默效應與對膽管側膜膽鹽輸出泵(Bsep)的影響。方法針對大鼠PDZK1基因序列,篩選3個干擾靶點,合成其3對小干擾RNA,將各對siRNA分別轉入BRL-3A細胞,采用PCR和Western blot方法從中篩選出最佳siRNA;設計合成針對最佳siRNA序列的shRNA,與載體LV3 (H1/GFP&Puro)連接,共轉染293T細胞,包裝成介導PDZK1基因沉默的LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體;感染BRL-3A細胞,熒光顯微鏡下觀察經感染的BRL-3A細胞的GFP表達情況,在mRNA和蛋白水平檢測重組慢病毒LV3/PDZK1 shRNA對BRL-3A細胞的PDZK1基因的沉默效應及對Bsep的影響。結果篩選到PDZK1基因的最佳干擾靶序列。經酶切與測序結果證實,構建LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體成功。BRL-3A細胞經LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染48 h后,PCR檢測PDZK1基因表達極低,Bsep表達較弱;WB檢測顯示PDZK1、Bsep蛋白表達均極弱。結論成功構建大鼠PDZK1基因RNA干擾慢病毒載體,該載體能有效沉默BRL3A細胞的PDZK1基因,并抑制膽管側膜Bsep表達。