人組織因子途徑抑制因子在畢赤酵母中高拷貝表達

摘要：目的構建高拷貝表達重組人組織因子途徑抑制因子的畢赤酵母并對蛋白表達條件進行初步優化，為相關研究奠定基礎。方法將PCR擴增得到的TFPIcDN段與表達質粒pPIC9K連接構建重組質粒rhTFPI—pPIC9K，采用PCR方法及DNA測序對其進行鑒定。將重組質粒轉化酵母細胞GSI15，利用G418抗性實驗篩選含有高拷貝TFPIcDNA的畢赤酵母菌株，采用WesternBlot和TFPI檢測試劑盒分析重組蛋白表達。通過改變誘導溫度、誘導時間及甲醇濃度對重組蛋白表達條件進行初步優化。結果PCR擴增rhTFPI-pPIC9K得到預期的擴增條帶（1．2kb），經酶切圖譜分析及測序確認成功構建表達質粒rhTFPI—pPIC9K。實時定量PCR結果顯示，通過G418篩選獲得了含高拷貝基因的酵母細胞，WesternBlot結果顯示含基因拷貝數與蛋白表達量呈正相關。通過對表達條件的優化，明顯提高了TFPI重組蛋白的表達量，重組TFPI表達量高達（9．95±0．78）mg／L，活性達到（3．91±1．37）U／mL。結論成功構建了高效表達TFPI重組蛋白的畢赤酵母細胞株，為TFPI功能研究及在相關疾病防治中的應用提供了堅實的實驗基礎。