綿羊痘病毒甘肅古浪株RING finger基因的克隆表達及序列分析

摘要：【目的】對綿羊痘病毒甘肅古浪株RING finger蛋白的基因進行克隆,表達以及序列分析,初步探究綿羊痘病毒RING finger蛋白是否具有E3泛素連接酶活性,為闡明其在綿羊痘病毒感染過程中對泛素蛋白酶體系統的調控作用奠定基礎.【方法】以綿羊痘病毒甘肅古浪株DNA為模板,通過PCR擴增 RING finger 基因.利用Pfam數據庫、DNAstar等軟件進行序列及遺傳進化分析;將 RING finger 基因片段插入原核表達載體pGEX-4T-1中,構建pGEX-SPPVRFP重組表達載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達,并進行SDS-PAGA和Western-blot分析.【結果】綿羊痘病毒 RING finger 基因由723個核苷酸組成,編碼的240個氨基酸的分子量約為28.5 ku,具有RING finger結構域.不同羊痘病毒株間 RING finger 基因核苷酸序列同源性高達99.2%,氨基酸序列同源性高達98.3%.不同的RING finger蛋白都含有8個保守的半胱氨酸和組氨酸.SDS-PAGA分析顯示,重組SPPVRFP大小約為55 ku,Western-blot分析顯示,重組SPPVRFP不能與綿羊痘病毒陽性血清反應.【結論】成功克隆、表達并純化了綿羊痘病毒 RING finger 基因,對SPPV GS-GL株RING-finger蛋白進行序列分析,推測其可能具有E3泛素連接酶活性.