人Spsb1基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建及病毒包裝

摘要：目的：構(gòu)建人Spsb1基因的shRNA慢病毒干擾載體,為研究該基因在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)中的作用打下前期基礎(chǔ)。方法：根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)一段shRNA和陰性對(duì)照shRNA,化學(xué)合成DNA雙鏈中的兩條單鏈,通過退火和配對(duì)后與慢病毒干擾載體LV-3（p GLVH1/GFP＋Puro）連接,陽(yáng)性克隆子LV3-Spsb1測(cè)序鑒定;將LV3-Spsb1和輔助質(zhì)粒p CMV-delta8.91/p CMV-VSVG共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率;用轉(zhuǎn)染后收集到的病毒液感染肝癌細(xì)胞SMMC-7721,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光;用1 mg/L嘌呤霉素殺死未感染的細(xì)胞,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性Spsb1基因表達(dá)量。結(jié)果：測(cè)序鑒定證明獲得的LV3-Spsb1質(zhì)粒是所需要的目的慢病毒shRNA干擾載體;通過與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光,提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高;病毒液感染SMMC-7721后,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光,證明共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以成功包裝shRNA-Spsb1重組慢病毒顆粒;Western blot結(jié)果顯示shRNA-Spsb1重組慢病毒能夠抑制細(xì)胞內(nèi)Spsb1基因表達(dá),證明shRNA-Spsb1的確可以降低肝癌細(xì)胞內(nèi)源性Spsb1基因表達(dá),可用于后期的基因功能研究。結(jié)論：成功構(gòu)建人Spsb1基因的慢病毒shRNA干擾載體LV3-Spsb1并包裝出其慢病毒顆粒。