三種組成型啟動子調控的鼠李糖脂基因在防御假單胞菌中的異源表達及活性研究

摘要：本研究利用Red/ETDNA重組技術對實驗室已有的含鼠李糖基轉移酶基因RhlAB的分泌表達載體pBBR1-genta-RhlAB進行修飾,將3種不同強度組成型啟動子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替換了RhlAB基因在銅綠假單胞菌中的原始啟動子,成功獲得了表達載體pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并將這些表達載體分別在防御假單胞菌Pf-5中異源表達,通過LB培養基發酵42h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂產量為17.56mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分別是11.135mg/L,441.135mg/L,557.764mg/L,啟動子優化后產量分別是原始啟動子的0.63,25.12和31.76倍。對發酵產物進行高效液相色譜-質譜聯用技術分析,共檢出相對含量變化的4類質核比不同的鼠李糖脂同系物。并通過實時熒光定量PCR檢測RhlAB基因的表達量,發現啟動子替換為Ptac和PrhaB后RhlAB基因表達量分別是原始啟動子的2.16和2.77倍。本研究初步實現了RhlAB基因在Pf-5中的表達,發現組成型啟動子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始啟動子表達效率更高,可為異源合成鼠李糖脂提供重要參考。