含心臟阿霉素反應蛋白基因的重組慢病毒過表達和RNA干擾載體的構建及鑒定

摘要：目的:構建心臟阿霉素反應蛋白(CARP)基因重組慢病毒過表達和RNA干擾載體并進一步包裝慢病毒,為研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及機制奠定基礎。方法:將PCR擴增的大鼠CARP基因序列和設計合成的短發夾RNA(shRNA)序列分別插入GV-358和GV-248表達載體,行DNA測序鑒定。采用重組CARP過表達和shRNA表達穿梭載體與Helper 1.0和Helper 2.0輔助包裝質粒共轉染人胚腎細胞HEK293T,進行病毒包裝和擴增,采用終點稀釋法測定病毒滴度。采用重組慢病毒感染HEK293T細胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光強度。采用重組慢病毒感染H9C2細胞,分為對照組、Scramble RNA組、CARP過表達組和shRNA CARP組,Western blotting法檢測各組細胞中CARP蛋白表達水平。結果:基因測序,CARP過表達及shRNA載體序列與原設計序列完全相符。載體轉染HEK293T細胞后,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達。包裝的CARP過表達及shRNA病毒感染H9C2細胞后,與對照組比較,CARP過表達組細胞中CARP蛋白表達水平升高5.3倍(P=0.01),shRNA CARP組細胞中CARP蛋白表達水平降低53%(P=0.02)。結論:成功構建了CARP過表達和特異性shRNA慢病毒表達載體并獲得高感染效率的過表達和RNA干擾慢病毒,后者在H9C2細胞中能夠干預CARP表達。