摘要：目的培育一種HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技術(shù),通過同源重組的方式分別在Rosa26基因位點(diǎn)定點(diǎn)插入pliver-HBeAg表達(dá)框,獲得含有HBeAg基因的表達(dá)載體pliver-HBeAg,經(jīng)酶切得到含有HBeAg基因的線性DN段,將Cas9mRNA、gRNA和donor vector顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再將其移植入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宮,獲得F0代建系小鼠;采用長片段PCR對(duì)出生小鼠進(jìn)行鑒定,共獲得HBeAg基因正確同源重組的F0代建系小鼠;F0代陽性小鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育獲得F1代小鼠,經(jīng)PCR鑒定及測序確認(rèn)陽性F1代小鼠;將攜帶HBeAg基因的F1代轉(zhuǎn)基因小鼠再次回交,對(duì)子代小鼠進(jìn)行PCR基因型鑒定,直至獲得純合子子代轉(zhuǎn)基因小鼠;采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、膠體金法和免疫組織化學(xué)方法分別檢測HBeAg轉(zhuǎn)基因鼠血漿和肝組織中HBeAg和HBeAb的表達(dá)。結(jié)果采用CRISPR/Cas9技術(shù)共獲得56只F0代小鼠,其中2只為正確同源重組的F0代小鼠;F1代小鼠中6只陽性F1代小鼠。截至目前,共獲得22只F2代純合子和29只雜合子HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠。所有HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中均可檢出高濃度的HBeAg蛋白,但未檢出HBeAb的表達(dá)。而且免疫組化結(jié)果顯示HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟肝細(xì)胞中可特異性表達(dá)HBeAg蛋白。結(jié)論采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了能在肝臟肝細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)HBeAg蛋白且對(duì)HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠,為HBV的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。