采用CRISPR/Cas9技術構建新品系HBeAg轉基因小鼠

摘要：目的培育一種HBeAg轉基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技術,通過同源重組的方式分別在Rosa26基因位點定點插入pliver-HBeAg表達框,獲得含有HBeAg基因的表達載體pliver-HBeAg,經酶切得到含有HBeAg基因的線性DN段,將Cas9mRNA、gRNA和donor vector顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再將其移植入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宮,獲得F0代建系小鼠;采用長片段PCR對出生小鼠進行鑒定,共獲得HBeAg基因正確同源重組的F0代建系小鼠;F0代陽性小鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育獲得F1代小鼠,經PCR鑒定及測序確認陽性F1代小鼠;將攜帶HBeAg基因的F1代轉基因小鼠再次回交,對子代小鼠進行PCR基因型鑒定,直至獲得純合子子代轉基因小鼠;采用全自動化學發光免疫分析儀、膠體金法和免疫組織化學方法分別檢測HBeAg轉基因鼠血漿和肝組織中HBeAg和HBeAb的表達。結果采用CRISPR/Cas9技術共獲得56只F0代小鼠,其中2只為正確同源重組的F0代小鼠;F1代小鼠中6只陽性F1代小鼠。截至目前,共獲得22只F2代純合子和29只雜合子HBeAg轉基因小鼠。所有HBeAg轉基因小鼠外周血中均可檢出高濃度的HBeAg蛋白,但未檢出HBeAb的表達。而且免疫組化結果顯示HBeAg轉基因小鼠肝臟肝細胞中可特異性表達HBeAg蛋白。結論采用CRISPR/Cas9技術成功構建了能在肝臟肝細胞中穩定表達HBeAg蛋白且對HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg轉基因小鼠,為HBV的研究提供了新的實驗動物模型。