小鼠骨橋蛋白重組腺病毒的體外構建及表達

摘要：目的:構建表達小鼠骨橋蛋白(osteopontin,OPN)基因的重組腺病毒載體,并在主動脈平滑肌細胞(smooth musclecells,SMC)中初步探索其參與血管重塑的相關機制。方法:提取FVB/N遺傳背景小鼠的主動脈總RNA,利用針對OPN基因序列設計的特異性引物,應用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增OPN基因,將PCR產物酶切后連接入腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV載體中,構建pShuttle-CMV-OPN重組穿梭質粒。PCR及測序鑒定正確后,經酶切線性化轉染攜帶腺病毒骨架載體pAdEasy-1的BJ5183感受態細胞進行同源重組,獲得pAd-CMV-OPN重組腺病毒質粒。利用磷酸鈣法將線性化的pAd-CMV-OPN質粒轉染人源胚腎293AA (human embryo kidney 293AA,HEK293AA)細胞進行包裝和生產,獲得攜帶OPN基因的重組腺病毒。通過PCR檢測病毒原液中重組OPN質粒的包裝情況。利用已構建的OPN重組腺病毒感染小鼠SMC,初步探究OPN對血管重塑相關蛋白的調控。結果:成功構建攜帶OPN基因的重組腺病毒質粒,經磷酸鈣-DNA共沉淀轉染HEK293AA細胞后,7天可見明顯的細胞病變效應,8天后約有60%細胞脫落,收集細胞,反復凍融后分裝凍存。與空載體病毒相比,過表達OPN顯著上調血管重塑相關蛋白I型膠原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)的表達。結論:利用pAdEasy-1腺病毒載體系統成功構建攜帶OPN基因的重組腺病毒,在SMC中OPN可能通過上調Col Ⅰ與MMP-2參與血管重塑。