摘要：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) NMU2R shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體,制備并純化靶向性沉默 NMU2R 表達(dá)的高滴度重組腺相關(guān)病毒。首先設(shè)計(jì)合成 NMU2R shRNA,退火形成雙鏈與pAAV-ZsGreen-shRNA質(zhì)粒 Bam H I和 Hin d III雙酶切產(chǎn)物相連接構(gòu)建形成質(zhì)粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定證實(shí),重組質(zhì)粒克隆正確,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AAV-293包裝細(xì)胞中包裝成腺相關(guān)病毒載體,成功制備重組腺相關(guān)病毒rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經(jīng)測(cè)定純化所得rAAV5病毒滴度為1×10^12 vg/mL。最后將rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12,檢測(cè) NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒載體pAAV-ZsGreen-shRNA作對(duì)照,Real-time PCR及Western Blot方法測(cè)得 NMU2R mRNA及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著下降。綜上,成功構(gòu)建了高滴度攜帶 NMU2R shRNA重組腺相關(guān)病毒載體rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA。