攜帶NMU2R shRNA重組腺相關病毒載體的構建及其評價

摘要：構建穩定表達 NMU2R shRNA的重組腺相關病毒載體,制備并純化靶向性沉默 NMU2R 表達的高滴度重組腺相關病毒。首先設計合成 NMU2R shRNA,退火形成雙鏈與pAAV-ZsGreen-shRNA質粒 Bam H I和 Hin d III雙酶切產物相連接構建形成質粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經雙酶切和測序鑒定證實,重組質粒克隆正確,將重組質粒轉染到AAV-293包裝細胞中包裝成腺相關病毒載體,成功制備重組腺相關病毒rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA,經測定純化所得rAAV5病毒滴度為1×10^12 vg/mL。最后將rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12,檢測 NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒載體pAAV-ZsGreen-shRNA作對照,Real-time PCR及Western Blot方法測得 NMU2R mRNA及蛋白表達水平與對照組相比顯著下降。綜上,成功構建了高滴度攜帶 NMU2R shRNA重組腺相關病毒載體rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA。