EV713D聚合酶基因體外重組質粒的構建、表達及活性檢測

摘要：目的構建編碼腸道病毒71型(EV71)3D聚合酶基因的重組質粒,表達和純化3D聚合酶并檢測其活性。方法將編碼3D聚合酶的基因片段克隆至pGEX-4T-1原核表達載體,重組質粒轉化入大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導表達,經谷胱甘肽瓊脂糖親和層析、TEV酶酶切、Ni-NTA柱親和純化后獲得高純度3D聚合酶蛋白,放射測量法是體外酶活力測定方法中較常見的一種方法,本研究通過測定插入poly(U)RNA放射性標志UMP的量確定3D聚合酶的活性。結果經酶切、PCR、測序鑒定pGEX-4T-3D重組質粒構建成功,3D聚合酶基因片段大小為1 386 bp。與未誘導相比,經IPTG誘導后帶有GST標簽的3D聚合酶成功表達,表達產物的相對分子質量約為79×10~3,TEV酶酶切掉GST標簽后的相對分子質量約為55×10~3。純化的3D聚合酶經體外延伸反應后跑變性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳得知,3D聚合酶溶解液DMSO組相比于3D聚合酶強抑制劑EDTA組,在DMSO組中,可以觀察到強電泳條帶,表明放射性同位素標志程度強,表明反應速率快,即3D聚合酶酶活較好。結論構建了EV71 3D聚合酶基因重組質粒,其表達產物3D聚合酶為以EV71 3D聚合酶為靶點的抗EV71藥物篩選奠定基礎。