利用BiFC技術研究柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1結構域Ⅰ與棒狀體頸部蛋白2互作關系

摘要：為了驗證柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)頂膜抗原1結構域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)與棒狀體頸部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作關系,以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板,PCR擴增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并與pGEM-T-easy載體連接構建相應重組質粒。獲得的陽性重組質粒及雙分子熒光互補技術的真核表達載體pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II進行雙酶切,將E tAMA1-DⅠ、E tRON2分別與pBiFC-VN155、pBiFC-VC155連接,構建真核重組質粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。將2個真核重組質粒分別轉染BHK細胞進行表達,經間接免疫熒光鑒定,可在BHK細胞中成功表達。將2個真核重組質粒共轉染至BHK細胞中,同時將pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共轉染至細胞中分別作為陽性和陰性對照組。BiFC結果發現真核重組質粒共轉染組和陽性對照組的BHK細胞均產生綠色熒光,而陰性對照組無熒光,表明E tAMA1-DⅠ與E tRON2蛋白之間存在互作關系。本研究結果為深入研究E tAMA1及E tRON2在球蟲入侵過程中的功能與作用機制奠定基礎。