蛋白激酶9在約氏瘧原蟲生長發育中的作用

摘要：目的探究蛋白激酶9 (PK9)在約氏瘧原蟲生長發育中的作用。方法基于瘧原蟲PlasmoDB數據庫,查找約氏瘧原蟲致死株17XL (Py17XL)的PK9序列信息, BLAST比對Py PK9和惡性瘧原蟲PK9(Pf PK9)以及人蛋白激酶p78的同源性。提取Py17XL株野生型(WT)基因組DNA,設計引物, PCR擴增PK9基因。采用CRISPR-Cas9技術,將同源臂與sgRNA序列一起連接到PYC-MCS質粒中,構建PK9基因敲除(PK9KO)重組質粒。重組質粒電轉至Py17XL蟲株內,經乙胺嘧啶篩選、克隆,進行PCR鑒定和測序。10只雌性BALB/c小鼠隨機分為WT感染組和PK9KO感染組,每組5只,重復3次實驗。每鼠腹腔注射1×105個紅內期瘧原蟲,每隔24 h取血檢測小鼠原蟲血癥,觀察小鼠存活情況。200只3~5日齡的斯氏按蚊隨機分為WT感染小鼠吸血組和PK9KO感染小鼠吸血組,每組100只。于吸血8 d后解剖蚊胃,每組隨機選取15只斯氏按蚊進行解剖,測定蚊胃中卵囊的數量。10只雌性BALB/c小鼠隨機分為WT子孢子感染組和PK9KO子孢子感染組,每組5只,重復2次實驗。每鼠尾靜脈注射1×103個子孢子,每隔12 h取血,涂片觀察其原蟲血癥出現時間。結果Py PK9與Pf PK9的序列一致性為82.5%, Py PK9和人類蛋白激酶p78的一致性為39.4%。PK9基因PCR擴增產物的長度約為597 bp。經PCR鑒定、測序確定PK9KO重組質粒構建成功, Py17XL蟲株成功敲除PK9基因。WT感染組小鼠迅速出現原蟲血癥,感染后5~6 d全部死亡, PK9KO感染組小鼠全部存活,原蟲血癥在感染后17 d消失。WT感染小鼠吸血組和PK9KO感染小鼠吸血組的斯氏按蚊感染率分別為60.0%(9/15)和66.7%(10/15),差異無統計學意義(P> 0.05)。WT子孢子感染組和PK9KO子孢子感染組小鼠均于72 h查見原蟲血癥。結論PK9在紅內期Py17XL的毒力中發揮了重要作用。