FoxO1抑制劑細(xì)胞篩選模型的構(gòu)建與應(yīng)用

摘要：目的構(gòu)建含有人叉頭框蛋白O1(FoxO1)結(jié)合靶位點(diǎn)(即胰島素反應(yīng)元件,IRE)的以螢火蟲(chóng)熒光素酶(Luc2)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為雙報(bào)告基因的FoxO1抑制劑高通量篩選細(xì)胞模型,進(jìn)行FoxO1抑制劑的篩選,并對(duì)獲得的陽(yáng)性化合物細(xì)胞活性進(jìn)行初步研究,以期獲得能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病的先導(dǎo)化合物或候選藥物。方法用分子生物學(xué)的方法,構(gòu)建含有胰島素反應(yīng)元件的并連接Luc2和EGFP雙報(bào)告基因的重組載體pc-IRE-LE。將體外培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞用該重組載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,分別利用螢火蟲(chóng)熒光素酶試劑盒和熒光顯微鏡對(duì)熒光素酶活性及綠色熒光蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),從而構(gòu)建細(xì)胞模型并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和評(píng)價(jià)。應(yīng)用該細(xì)胞模型對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選,隨后利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性化合物的FoxO1抑制劑活性,即對(duì)FoxO1多個(gè)糖脂代謝相關(guān)靶基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果成功構(gòu)建了具有Luc2和EGFP雙報(bào)告基因的FoxO1抑制劑高通量篩選細(xì)胞模型,并完成了模型評(píng)價(jià)。經(jīng)過(guò)對(duì)6000余個(gè)化合物的篩選,共獲得6個(gè)具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系的陽(yáng)性化合物。其中化合物7625-H9在模型上表現(xiàn)出良好的FoxO1抑制劑活性,并在細(xì)胞上對(duì)FoxO1多個(gè)靶基因PEPCK、G6Pase、apoC-Ⅲ和MTP的mRNA水平均有顯著的抑制作用。結(jié)論該模型符合高通量篩選的要求,可用于FoxO1抑制劑的高通量篩選。該模型的應(yīng)用將為新型調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂藥物的發(fā)現(xiàn)提供一個(gè)可靠而有效的方法。