首頁 > 精品范文 > 干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)精品(七篇)
時(shí)間：2023-06-30 15:46:05
序論：寫作是一種深度的自我表達(dá)。它要求我們深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隱藏在內(nèi)心深處的真相，好投稿為您帶來了七篇干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文，愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑，助力您的創(chuàng)作。
篇(1)
達(dá)情況，著重觀察單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與時(shí)間。結(jié)果 以有限稀釋法獲取192個(gè)Tca8113M1舌癌單個(gè)細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲取12個(gè)細(xì)胞亞系（獲取比例為6.25%），均有高成瘤性。癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD44
與ESA均為高水平表達(dá)，而CD184表達(dá)則在12個(gè)細(xì)胞系之間有差異。在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態(tài)，12個(gè)細(xì)胞亞系均源于單個(gè)細(xì)胞形成的完全克隆，均可進(jìn)行連續(xù)傳代與擴(kuò)增，而部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡。結(jié)論 Tca8113M1細(xì)胞系中可能存在癌干細(xì)胞，而單細(xì)胞培養(yǎng)可形成完全克隆并建立細(xì)胞亞系，是進(jìn)行舌癌干細(xì)胞后續(xù)研究重要的細(xì)胞培養(yǎng)模式。
[關(guān)鍵詞] 單細(xì)胞； 有限稀釋法； 舌癌干細(xì)胞； 完全克隆
[中圖分類號(hào)] Q 21 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細(xì)胞是癌組織中一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有自我復(fù)制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強(qiáng)，少量細(xì)胞即可形成體外移植瘤[1]。近年
有關(guān)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥與復(fù)發(fā)等諸多難題均從癌干細(xì)胞的角度進(jìn)行研究。這種研究的基礎(chǔ)和前提是明確癌干細(xì)胞的標(biāo)志或分離出癌干細(xì)胞，以提供研究的靶細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)多種永生性癌細(xì)胞系中存在有癌干細(xì)胞，Tca8113M1舌癌細(xì)胞系同樣可能存在有癌干細(xì)胞，可以作為舌癌干細(xì)胞的研究對(duì)象。鑒于癌干細(xì)胞獨(dú)特的自我復(fù)制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用有限稀釋法分離出單個(gè)舌癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用癌干細(xì)胞的自我復(fù)制能力進(jìn)行分裂增殖，形成預(yù)期的單細(xì)胞克隆，進(jìn)一步形成細(xì)胞亞系，以此證明Tca8113M1
舌癌細(xì)胞系中存在癌干細(xì)胞的可能性，同時(shí)檢測細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)情況，觀察不同細(xì)胞亞系的生物學(xué)特性，并且動(dòng)態(tài)觀察單細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞克隆形成的規(guī)律，為從Tca8113M1細(xì)胞系中分離舌癌干細(xì)胞提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 舌癌細(xì)胞系來源
人舌癌細(xì)胞系Tca8113由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室建系，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院贈(zèng)送。右江民族醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上建立了轉(zhuǎn)移人舌癌細(xì)胞系Tca8113M1[2]。
1.2 主要試劑和儀器
胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培
養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；PE標(biāo)記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗人細(xì)胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-
gen，ESA）抗體，PE/cy5標(biāo)記抗人CD184抗體，同
型對(duì)照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日
本）。
1.3 體外單細(xì)胞培養(yǎng)、建系及細(xì)胞克隆生長的動(dòng)態(tài)
觀察
采用有限稀釋法進(jìn)行體外單細(xì)胞培養(yǎng)與建系。Tca8113M1細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個(gè)孔有1個(gè)細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個(gè)細(xì)胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)移至6孔板擴(kuò)增培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中反復(fù)傳代建立細(xì)胞亞系。此外，在此培養(yǎng)過程中動(dòng)態(tài)觀察單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與生長情況，觀察時(shí)點(diǎn)分別為3 d和1、2、3周。
1.4 舌癌細(xì)胞亞系成瘤性檢測
建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養(yǎng)Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系細(xì)胞，選取形態(tài)良好的生長期細(xì)胞，在生長旺盛時(shí)接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細(xì)胞，800 r?min-1離心3～
5 min，棄上清液，計(jì)數(shù)細(xì)胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按每毫升1×107個(gè)細(xì)胞的密度稀釋細(xì)胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細(xì)胞接種于皮下，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過1.0 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系組，共12個(gè)亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細(xì)胞組，6只，為母系細(xì)胞系對(duì)照組；3）Tca8113舌癌細(xì)胞組，3只，為來源細(xì)胞系對(duì)照組。
1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測舌癌細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)
志CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況
將舌癌細(xì)胞（密度為每毫升1×106個(gè)）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細(xì)胞吹散，將細(xì)胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設(shè)置對(duì)照管和樣本管。在對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠
IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標(biāo)記抗人CD44、FITC標(biāo)記抗人ESA、PE/cy5
標(biāo)記抗人CD184）各5 μL，置于避光環(huán)境下室溫孵育30 min，然后于流式細(xì)胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況。
2 結(jié)果
2.1 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞建系培養(yǎng)
Tca8113M1單細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞貼壁；24 h后部分細(xì)胞出現(xiàn)變大變薄、空泡樣變等老化現(xiàn)象；3 d后，有7個(gè)孔的細(xì)胞出現(xiàn)增殖分裂現(xiàn)象；7～10 d后有12個(gè)孔的細(xì)胞開始增殖為單個(gè)或數(shù)個(gè)完全細(xì)胞克隆（克隆形成過程見圖l）。
培養(yǎng)4～6周后，細(xì)胞基本達(dá)到穩(wěn)定生長并增殖的狀態(tài)，以癌細(xì)胞的克隆樣生長為主，細(xì)胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細(xì)胞，核分裂象多見。待培養(yǎng)孔接近80%鋪滿時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板上擴(kuò)增培養(yǎng)，1～2周后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個(gè)Tca8113M1舌癌單細(xì)胞，并在96孔板中進(jìn)行體外傳代建系培養(yǎng)，獲取12個(gè)細(xì)胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。
2.2 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆
的動(dòng)態(tài)觀察
以3 d和1、2、3周為觀察時(shí)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細(xì)胞亞系的細(xì)胞均源于單個(gè)細(xì)胞形成的完全克隆，均可以進(jìn)行連續(xù)傳代與細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，而其他單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成的部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡，未能連續(xù)傳代進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。3種克隆在培養(yǎng)過程中的變化情況如下。1）完全克隆：細(xì)胞之間緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時(shí)在細(xì)胞克隆中央出現(xiàn)細(xì)胞重疊生長現(xiàn)象（圖2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形態(tài)界于旁克隆與完全克隆之間，細(xì)胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細(xì)胞克隆疏松，形狀消散，
有轉(zhuǎn)變?yōu)榕钥寺〉内厔荩▓D2中B1～B4）；3）旁克隆：
細(xì)胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細(xì)胞老化（圖2中C1～C4）。
2.3 Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系成瘤情況
將舌癌細(xì)胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結(jié)節(jié)，表面光滑、質(zhì)硬、可活動(dòng)；2周后可見皮下結(jié)節(jié)生長迅速；3～4周后皮下結(jié)節(jié)最大直徑達(dá)1.0 cm以上。含對(duì)照組在內(nèi)的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。
2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志
CD44、CD184、ESA表達(dá)情況
流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達(dá)率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細(xì)胞亞系ESA的陽性表達(dá)率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達(dá)率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個(gè)亞系的CD184表達(dá)存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動(dòng)。
3 討論
本研究利用有限稀釋法等經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以舌癌Tca8113M1細(xì)胞系為研究對(duì)象，隨機(jī)選取192個(gè)舌癌細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)，共建立12個(gè)舌癌Tca8113細(xì)胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強(qiáng)的成瘤性。進(jìn)一步檢測12個(gè)Tca8113細(xì)胞亞系的癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD44與ESA均為高水平表達(dá)，陽性表達(dá)率多在90%左右，而CD184的陽性表達(dá)率則各有不同。據(jù)此結(jié)果可以結(jié)合癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞系進(jìn)行分析。
本研究發(fā)現(xiàn)：舌癌Tca8113M1細(xì)胞系中有6.25%的單個(gè)細(xì)胞可以進(jìn)行自我分裂、增殖，形成細(xì)胞亞系。還有研究[3]發(fā)現(xiàn)：Tca8113細(xì)胞連續(xù)經(jīng)過兩次單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中具備分裂增殖活性的細(xì)胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細(xì)胞系中，具備持續(xù)增殖能力的細(xì)胞占整個(gè)群體的比例都較少。根據(jù)目前的文獻(xiàn)[4]報(bào)道，在癌細(xì)胞群或組織中，癌干
細(xì)胞比例為0.01%～5%；體外培養(yǎng)的永生化癌干細(xì)胞系中，癌干細(xì)胞的比例可能偏高一些。本研究采用經(jīng)典的有限稀釋法獲取單個(gè)細(xì)胞，這種細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強(qiáng)的細(xì)胞亞系。這些單個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞是否就是癌干細(xì)胞尚需進(jìn)行單細(xì)胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應(yīng)該包含有癌干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞的概念于20世紀(jì)60年代提出，并據(jù)此建立了腫瘤細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)。本研究在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個(gè)細(xì)胞克隆后擴(kuò)大生長，并且在周圍形成小的細(xì)胞克隆，最后融合成片，但究其細(xì)胞來源就是一個(gè)癌細(xì)胞而已，所有后續(xù)的細(xì)胞克隆與癌細(xì)胞就是源于它，所以可以認(rèn)為該細(xì)胞具有癌干細(xì)胞的潛質(zhì)，可以考慮從癌細(xì)胞系中篩選癌干細(xì)胞。
在12個(gè)Tca8113細(xì)胞亞系中，為明確其癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)情況，為后續(xù)舌癌干細(xì)胞的篩選提供前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究綜合文獻(xiàn)報(bào)道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志進(jìn)行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結(jié)腸癌等上皮組織的癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志，CD184是胰腺癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志；ESA則是上皮來源的癌干細(xì)胞標(biāo)志，而且屬于細(xì)胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個(gè)細(xì)胞亞系中，
CD44與ESA均處于高水平表達(dá)，而CD184的表達(dá)則高低不一，其中亞系間均數(shù)差值最大者接近60%。從這3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)情況來分析，可以進(jìn)行如下推測：1）CD44與ESA是不同細(xì)胞亞系共有的標(biāo)志，提示這些細(xì)胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達(dá)提示Tca8113細(xì)胞系中存在細(xì)胞異質(zhì)性，但從其比例來看，大致有3個(gè)等級(jí)，即15%、30%、50%以上，提示其生物學(xué)特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細(xì)胞研究的候選細(xì)胞群體進(jìn)行研究。
此外，在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立細(xì)胞亞系的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與細(xì)胞最后成系關(guān)系密切。在單個(gè)細(xì)胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細(xì)胞亞系，而且這些細(xì)胞亞系表現(xiàn)出腫瘤的異質(zhì)性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴(kuò)增培養(yǎng)過程中逐漸老化或消亡。這一結(jié)果可進(jìn)行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個(gè)細(xì)胞確定為舌癌干細(xì)胞，而其形成的完全克隆則是癌干細(xì)胞自我更新與增殖的結(jié)果，其中可能富含癌干細(xì)胞。這一觀點(diǎn)也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等相關(guān)研究[7-12]所證實(shí)。這些研究發(fā)現(xiàn)完全克隆細(xì)胞可以高表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)志；接種1 000個(gè)完全克隆前列腺癌細(xì)胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養(yǎng)的癌細(xì)胞球在消化后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，可以形成高比例的完全克隆。有學(xué)者[13]進(jìn)一步在頭頸腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CD133與CD44陽性表達(dá)的癌細(xì)胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細(xì)胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認(rèn)為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細(xì)胞的標(biāo)志。由此可見，完全克隆為癌干細(xì)胞的自我更新方式與富集、純化癌
干細(xì)胞及癌干細(xì)胞標(biāo)志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細(xì)胞研究中逐漸被應(yīng)用和關(guān)注[11]。此外，針對(duì)完全克隆的研究切入時(shí)間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)1～2周時(shí)形成，最好不要超過3周；擴(kuò)增培養(yǎng)后，可使癌干細(xì)胞比例減少或分化細(xì)胞比例增加，從而影響對(duì)癌干細(xì)胞行為學(xué)的觀察。
本研究屬于尋找舌癌干細(xì)胞的前期性和階段性實(shí)驗(yàn)，但是結(jié)果很有意義，這12個(gè)細(xì)胞亞系表明了Tca8113M1細(xì)胞系中有存在舌癌干細(xì)胞的可能性，而其最初的來源細(xì)胞系Tca8113也應(yīng)存在癌干細(xì)胞。結(jié)合細(xì)胞克隆形態(tài)分析的單個(gè)癌細(xì)胞培養(yǎng)模式可為深入研究舌癌干細(xì)胞提供細(xì)胞研究平臺(tái)。
[參考文獻(xiàn)]
[1] Tan BT， Park CY， Ailles LE， et al. The cancer stem cell hypo-
thesis： A work in progress[J]. Lab Invest， 2006， 86（12）：1203-
1207.
[2] 姚金光， 鄺曉聰， 溫冠媚， 等. 舌鱗狀細(xì)胞癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模
型建立的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 右江醫(yī)學(xué)， 2006， 34（6）：581-583.
Yao Jinguang， Kuang Xiaocong， Wen Guanmei， et al. Establish-
ment of the tongue squamous cell carcinoma lymphatic metastasis
model of the nude mouse[J]. Youjiang Medical J， 2006， 34（6）：
581-583.
[3] 王開， 康非吾， 閔睿， 等. Tca8113細(xì)胞系單細(xì)胞體外增殖的實(shí)
驗(yàn)觀察[J]. 口腔頜面外科雜志， 2008， 18（6）：398-401.
Wang Kai， Kang Feiwu， Min Rui， et al. Proliferation potentials of
Tca8113 cell line in human tongue squamous carcinoma[J]. J Oral
Maxillofac Surg， 2008， 18（6）：398-401.
[4] Jordan CT， Guzman ML， Noble M. Cancer stem cells[J]. N Engl
J Med， 2006， 355（12）：1253-1261.
[5] Woodward WA， Sulman EP. Cancer stem cells： Markers or bio-
markers[J]. Cancer Metastasis Rev， 2008， 27（3）：459-470.
[6] Hermann PC， Huber SL， Herrler T， et al. Distinct populations of
cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity
in human pancreatic cancer[J]. Cell Stem Cell， 2007， 1（3）：313-
323.
[7] Locke M， Heywood M， Fawell S， et al. Retention of intrinsic stem
cell hierarchies in carcinoma-derived cell lines[J]. Cancer Res，
2005， 65（19）：8944-8950.
[8] Biddle A， Liang X， Gammon L， et al. Cancer stem cells in squa-
mous cell carcinoma switch between two distinct phenotypes that
are preferentially migratory or proliferative[J]. Cancer Res， 2011，
71（15）：5317-5326.
[9] Miloszewska J， Gos M， Przybyszewska M， et al. Mouse sarcoma
L1 cell line holoclones have a stemness signature[J]. Cell Prolif，
2010， 43（3）：229-234.
[10] Pfeiffer MJ， Schalken JA. Stem cell characteristics in prostate can-
cer cell lines[J]. Eur Urol， 2010， 57（2）：246-254.
[11] Zhou ZH， Ping YF， Yu SC， et al. A novel approach to the iden-
tification and enrichment of cancer stem cells from a cultured hu-
man glioma cell line[J]. Cancer Lett， 2009， 281（1）：92-99.
[12] Li H， Chen X， Calhoun-Davis T， et al. PC3 human prostate car-
cinoma cell holoclones contain self-renewing tumor-initiating cells
[J]. Cancer Res， 2008， 68（6）：1820-1825.
[13] Zhang S， Balch C， Chan MW， et al. Identification and charac-
篇(2)
關(guān)鍵詞： 植物 干細(xì)胞 教學(xué)應(yīng)用
干細(xì)胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一類細(xì)胞，目前學(xué)習(xí)者對(duì)動(dòng)物干細(xì)胞的理論和應(yīng)用知識(shí)掌握較多。由于植物細(xì)胞的全能型，長期以來很多學(xué)習(xí)者誤認(rèn)為植物中不存在干細(xì)胞，再加上教師對(duì)干細(xì)胞這部分內(nèi)容的講授不透徹，造成學(xué)習(xí)者對(duì)植物干細(xì)胞、動(dòng)物干細(xì)胞及植物愈傷組織細(xì)胞的概念往往混淆不清，存在植物干細(xì)胞認(rèn)知上的錯(cuò)誤，因此很有必要對(duì)植物干細(xì)胞的相關(guān)知識(shí)進(jìn)行總結(jié)。
1.植物干細(xì)胞
1.1植物干細(xì)胞的概念和特征。植物干細(xì)胞是位于植物分生組織中固有的未分化細(xì)胞，具有自我更新和再生能力。植物干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力，并且可以分化為特化的細(xì)胞類型，這些特化的細(xì)胞產(chǎn)生新的植物器官（根、莖、葉和花等）。這些細(xì)胞表型的變化是由影響植物功能的基因表達(dá)變化引起的，受到內(nèi)源性和外源性的信號(hào)共同調(diào)節(jié)[1]。植物干細(xì)胞的特征包括：能夠形成所有分化細(xì)胞的類型；具有自我更新的能力，維持干細(xì)胞的數(shù)量；位于分生組織。
1.2植物干細(xì)胞與動(dòng)物干細(xì)胞的比較。在動(dòng)物中，通常將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有全能性，它可以分化形成所有的成體組織細(xì)胞，甚至發(fā)育成為完整的個(gè)體；成體干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等）大多為多能干細(xì)胞，它們具有多向分化的潛能，可以分化形成除自身組織細(xì)胞外的其他組織細(xì)胞，真正具有全能性的細(xì)胞是受精卵和其分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞。與此相比，許多植物干細(xì)胞具有旺盛的再生能力，在干細(xì)胞的整個(gè)生活周期中能使植物生長并且產(chǎn)生新的器官（如植物莖端分生組織中的干細(xì)胞和根端分生組織中的干細(xì)胞）[2]。
1.3植物干細(xì)胞與植物愈傷組織細(xì)胞的比較。植物愈傷組織細(xì)胞是由成體細(xì)胞經(jīng)過脫分化而形成的具有分化能力的細(xì)胞，雖然愈傷組織的分化能力與植物干細(xì)胞相似，但它們?cè)趤碓础⒓?xì)胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈傷組織細(xì)胞來源于異質(zhì)性的體細(xì)胞，它是體細(xì)胞對(duì)損傷的暫時(shí)響應(yīng)，是一個(gè)臨時(shí)獲得刺激的細(xì)胞，盡管愈傷組織具有干細(xì)胞樣屬性，但愈傷組織不易維持穩(wěn)定的細(xì)胞分裂[3]。而植物干細(xì)胞來源于植物分生組織的同質(zhì)性細(xì)胞，它們?cè)谥参锏恼麄€(gè)生命周期可以產(chǎn)生并形成新的組織和器官。
2.植物干細(xì)胞的類別與調(diào)控
根據(jù)分生組織的種類，植物干細(xì)胞可分為莖尖分生組織中的干細(xì)胞和根尖分生組織中的干細(xì)胞。
2.1莖尖分生組織中的干細(xì)胞。莖尖分生組織包括中心區(qū)和中心區(qū)下方的帶狀區(qū)。中心區(qū)包括上部干細(xì)胞區(qū)和下部的組織中心（即干細(xì)胞區(qū)下部靠近帶狀區(qū)的小細(xì)胞群）。干細(xì)胞分裂時(shí)上部的干細(xì)胞分裂成兩部分子細(xì)胞，一部分干細(xì)胞后裔留在中心區(qū)并保持多能性；另一部分細(xì)胞則離開莖尖分生組織的中心區(qū)，但保持較快的分裂速度，最終分化為葉或者花原基器官，為側(cè)生器官的生長和分化提供保證[4]。目前已知的位于干細(xì)胞周圍“組織中心”的WUS（WUSCHEL）是保持莖尖干細(xì)胞特征的必要信號(hào)分子，它參與對(duì)莖尖干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，使整個(gè)植物莖尖干細(xì)胞保持連續(xù)不斷的自我更新和分化。
2.2根尖分生組織中的干細(xì)胞。靜止中心位于根尖分生組織中心，干細(xì)胞則圍繞在靜止中心細(xì)胞周圍。靜止中心作為組織中心維持周圍干細(xì)胞的穩(wěn)定和功能，靜止中心周圍的干細(xì)胞分布于中柱鞘外側(cè)，維管干細(xì)胞形成維管組織、皮層/內(nèi)皮層干細(xì)胞，進(jìn)而形成皮層、內(nèi)皮層與根冠干細(xì)胞，然后形成根冠細(xì)胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作為最主要的干細(xì)胞決定因子，特異的表達(dá)于根端分生組織的靜止中心，參與對(duì)根端干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，使整個(gè)植物的根尖干細(xì)胞保持連續(xù)不斷的自我更新和分化[4]。
3.植物干細(xì)胞的應(yīng)用
3.1生產(chǎn)天然產(chǎn)物，開發(fā)藥品或者化妝品。傳統(tǒng)的植物細(xì)胞培養(yǎng)存在細(xì)胞生長緩慢、生產(chǎn)成本高等問題，而植物干細(xì)胞培養(yǎng)具有遺傳穩(wěn)定、細(xì)胞生長率和生長模式穩(wěn)定、凝集程度低等優(yōu)點(diǎn)，可以用來大量生產(chǎn)有用的植物天然產(chǎn)物，并用于藥品、功能性食品、化妝品中。如懸浮培養(yǎng)紫杉干細(xì)胞可以生產(chǎn)松香烷型三環(huán)二萜、美麗紅豆杉素A和美麗紅豆杉素B等產(chǎn)物，以達(dá)到抑制腫瘤血管的生成和抗癌作用，而且其產(chǎn)值遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)值，具有很好的開發(fā)前景[5]。
3.2植物細(xì)胞系庫的建立和利用。一般的植物細(xì)胞凍存后存活率低，恢復(fù)生長能力慢，因此限制其在植物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。植物干細(xì)胞系在低溫儲(chǔ)藏方面有很大的優(yōu)勢，不僅有高的存活率，而且在低溫儲(chǔ)藏前后遺傳物質(zhì)沒有變異，是植物細(xì)胞系庫建立的很好材料。細(xì)胞系庫的建立不僅會(huì)使研究材料的供應(yīng)得到滿足，而且使植物細(xì)胞系的研究周期縮短，并在植物種子資源的保存和利用方面發(fā)揮重要作用[6]。除了以上應(yīng)用外，利用植物干細(xì)胞還可以進(jìn)行植物干細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制和分子設(shè)計(jì)育種等方面的研究。
4.結(jié)語
植物干細(xì)胞是位于植物分生組織中固有的未分化細(xì)胞，它們具有自我更新和再生能力。根據(jù)目前學(xué)習(xí)者對(duì)植物干細(xì)胞認(rèn)識(shí)不足的實(shí)際，本文對(duì)植物干細(xì)胞、動(dòng)物干細(xì)胞及植物愈傷組織細(xì)胞的概念進(jìn)行了辨析，并對(duì)植物干細(xì)胞的分類及應(yīng)用進(jìn)行了論述。學(xué)習(xí)者清楚植物干細(xì)胞、植物愈傷組織細(xì)胞和動(dòng)物干細(xì)胞的概念后，在學(xué)習(xí)植物干細(xì)胞的理論和應(yīng)用等方面時(shí)才能正確理解相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
[1]于榮敏，周良彬.食品與藥品[J].2012，14（01）：52-55.
[2]李寶鈞.哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].畜牧業(yè)，2008，234（10）：24-27.
[3]游云，蔣超，黃璐琦.試析植物干細(xì)胞與動(dòng)物干細(xì)胞的異同[J].中國中藥雜志.2014，39（2）：343-345.
[4]田奇琳，賴鐘雄.植物干細(xì)胞研究進(jìn)展[J].園藝與種苗，2013（8）：56-62.
篇(3)
放免法檢測胰島素分泌量。結(jié)果: 在大鼠β細(xì)胞素濃度為20～30 mg/L時(shí)， 大鼠胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量明顯高于對(duì)照組; 其胰島素分泌量明顯高于對(duì)照組(P
【關(guān)鍵詞】 β細(xì)胞素; 糖尿病 胰腺干細(xì)胞
胰島移植是治療糖尿病的一個(gè)熱點(diǎn)， 但供體的缺乏和存在免疫排斥反應(yīng)限制了其應(yīng)用。胰腺干細(xì)胞能定向分化成胰島細(xì)胞， 這為胰島移植提供了新的材料來源［1］。細(xì)胞生長因子在干細(xì)胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮了重要作用。研究表明， β細(xì)胞素（betacellulin， BTC）屬于表皮細(xì)
胞生長因子家族中的一個(gè)成員， 具有多種生物學(xué)功能， 胰腺BTC mRNA的高水平表達(dá)， 提示BTC可能在胰腺組織的發(fā)育中發(fā)揮重要的生理作用［2， 3］。本研究中通過建立穩(wěn)定的胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法， 將β細(xì)胞素用于胰腺干細(xì)胞的體外培養(yǎng)， 觀察其是否能促進(jìn)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成熟的胰島， 為克服胰島移植時(shí)的供體短缺提供新的胰島來源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（體質(zhì)量250 g， 雌雄不限， 飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房自由飲水和進(jìn)食， 手術(shù)前1 d禁飲食）由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供， Ⅴ型膠原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子2(basic fibroblast growth factor 2， bFGF2)、 角朊細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor， KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)購自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 購自杭州四季青生物制品公司; 雙硫腙（dithizone， DTZ）、 二甲基亞砜（DMSO）、 煙堿購
于華美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗體購自北京中山生物工程有限公司; 免疫組化SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 購于Gibco公司; 胰島素放射免疫分析試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所; 大鼠β細(xì)胞素由本研究室采用基因工程方法獲得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干細(xì)胞的分離、 培養(yǎng)
采用宋振順等［5］的方法， 首先以Ⅴ型膠原酶消化成年SD大鼠胰腺組織， 然后采用非連續(xù)密度梯度離
心法純化消化后的胰腺細(xì)胞， 去除胰島細(xì)胞后， 收集外分泌部細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。所獲的細(xì)胞培養(yǎng)在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培養(yǎng)液中， 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L鏈霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天將培養(yǎng)液改為DMEM/F12， 其中加入ITS（5 mU/L胰島素+5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B， 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L煙堿， 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d換液1次。于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和克隆形成情況。
1.2.2 胰腺干細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色
分別取培養(yǎng)3、 7、 14 d后的細(xì)胞爬片， 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后， PBS緩沖液沖洗玻片， 分別與兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗體4℃反應(yīng)過夜， 二抗及呈色反應(yīng)參照SP試劑盒說明。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色， 顯微鏡觀察， 自來水沖洗， 蘇木精復(fù)染， 中性樹膠封固。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。
1.2.3 雙硫腙染色與計(jì)數(shù)
雙硫腙(DTZ)為螯合劑， 可與鉛、 銅、 鋅等螯合， 人和動(dòng)物（豚鼠除外）的胰島β細(xì)胞因含有鋅， 雙硫腙染色呈猩紅色， 其他胰島細(xì)胞不著色。配制及染色方法: 用二甲基亞砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO， 用Hanks（pH7.8）1∶100稀釋， 0.22 μm濾膜過濾， DTZ與胰腺干細(xì)胞培養(yǎng)后轉(zhuǎn)分化形成的克隆混合， 室溫5～10 min后做鏡檢。按胰島的直徑>50 μm計(jì)數(shù)染色的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，
1.2.4 胰島素檢測
胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后形成的胰島克隆對(duì)葡萄糖刺激有胰島素分泌反應(yīng)。顯微鏡下挑取100個(gè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)克隆， 培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板， 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃下孵育1 h后， 更換為含高糖（16.7 mmol/L）加煙堿（10 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃下孵育2 h后， 取培養(yǎng)液上清， 采用放免法測定胰島素含量。
1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組
按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.1中胰腺干細(xì)胞的培養(yǎng)方法培養(yǎng)大鼠胰腺干細(xì)胞， 并將其設(shè)為正常對(duì)照組， 各實(shí)驗(yàn)組中分別加入不同濃度的大鼠β細(xì)胞素， 依次為10、 20、 30、 40、 50 mg/L， 共設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用Student t檢驗(yàn)方法， 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2 結(jié)果
2.1 成人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)變化
收獲的非胰島細(xì)胞于24～48 h內(nèi)部分黏著于培養(yǎng)瓶底。在第1～3天換液時(shí)， 大量漂浮于培養(yǎng)液中的外分泌細(xì)胞和胰島被棄除。培養(yǎng)5 d內(nèi)， 單個(gè)貼壁細(xì)胞迅速擴(kuò)增為鵝卵石樣小細(xì)胞片進(jìn)而分裂增殖成單層細(xì)胞。培養(yǎng)第3天改用無血清培養(yǎng)液及加入霍亂毒素， 可明顯地促進(jìn)導(dǎo)管上皮細(xì)胞的生長和抑制成纖維細(xì)胞的污染。細(xì)胞培養(yǎng)第7天胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)開始從細(xì)胞片或單層細(xì)胞的中央或邊緣出現(xiàn)， 同時(shí)鵝卵石樣細(xì)胞片迅速擴(kuò)大。此后大量胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)和囊狀細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。雙硫腙染色呈弱陽性。第21～27天， 大量較成熟的胰島樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，雙硫腙染色強(qiáng)陽性（圖1）。
2.2 免疫組織化學(xué)
（1）CK19染色: 細(xì)胞培養(yǎng)第1天， 4孔板中的部分細(xì)胞呈CK19抗體染色強(qiáng)陽性。此時(shí)的細(xì)胞多為貼壁的單個(gè)或小細(xì)胞片， 亦可見較多陰性反應(yīng)的細(xì)胞碎片。培養(yǎng)3 d后， 細(xì)胞片不斷擴(kuò)大， 第7天起， 可見胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)出現(xiàn)并逐漸增多， 絕大多數(shù)細(xì)胞集落和胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)均為CK19強(qiáng)陽性（圖2）。（2）PDX1染色: 培養(yǎng)第1天， 4孔玻板中的細(xì)胞大部呈PDX1抗體染色陽性。但在同一細(xì)胞片中細(xì)胞染色程度不一， 部分呈強(qiáng)陽性， 部分呈弱陽性， 少數(shù)細(xì)胞為陰性。第7天起， 可見胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)逐漸增多; 第11～27天， 胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)不斷增大， PDX1抗體染色呈強(qiáng)陽性(圖3)。
2.3 BTC對(duì)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的影響
在正常對(duì)照組中， 胰島克隆為（139±8.5）個(gè)/g胰腺， 各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中加入不同濃度的大鼠β細(xì)胞素后， 胰島克隆的數(shù)量明顯增加， 在大鼠β細(xì)胞素的濃度為20～30 mg/L時(shí)， 培養(yǎng)液中胰島樣細(xì)胞團(tuán)克隆的數(shù)量增加最為明顯
(P
2.4 胰島素分泌量的檢測
各實(shí)驗(yàn)組分別挑取100個(gè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)（直徑＞50 μm）， 培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中， 胰島素分泌試驗(yàn)結(jié)果表明， 在正常對(duì)照組中， 培養(yǎng)液上清中胰島素含量為（3.0±0.4）μU/100胰島。各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中加入不同濃度的大鼠β細(xì)胞素后， 培養(yǎng)液中胰島素的分泌量也有明顯增加， 在大鼠β細(xì)胞素的濃度為20～30 mg/L時(shí)， 培養(yǎng)液中胰島素的分泌量增加最為明顯(P
3 討論
由于胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的缺陷或缺乏導(dǎo)致的Ⅰ型糖尿病不僅對(duì)患者及其親屬， 而且對(duì)社會(huì)均帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。開發(fā)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞新的來源諸如豬的胰腺、 人體胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、 胎兒胰腺干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞成為目前研究的熱點(diǎn)。其中最有前景的是由人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)
分化為胰島β細(xì)胞。
本實(shí)驗(yàn)觀察到胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞在培養(yǎng)第1天， 絕大多數(shù)貼壁生長的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)。這些單個(gè)細(xì)胞和小細(xì)胞片在7 d 內(nèi)迅速生長擴(kuò)增為鵝卵石樣細(xì)胞片和大面積單層細(xì)胞片。胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)于培養(yǎng)第7天出現(xiàn)， 部分細(xì)胞PDX1 的表達(dá)及CK19 染色陽性從培養(yǎng)
第1天即開始。PDX1基因是一種在胰島細(xì)胞發(fā)育、成熟過程中有高表達(dá)的基因， 而CK19是胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志， 部分細(xì)胞PDX1的表達(dá)及CK19 染色陽性說明培養(yǎng)的細(xì)胞自第一天起即開始轉(zhuǎn)分化，這與Gmyr等［6］所報(bào)告的結(jié)果相似。
近年的研究表明， 一種肽類表皮細(xì)胞生長因子β細(xì)胞素（BTC）在活體動(dòng)物體內(nèi)能有效的促進(jìn)糖尿病鼠及90%胰腺切除鼠胰島細(xì)胞的再生和成熟［7］， 將大鼠胰腺切除90%后， 立即給大鼠尾靜脈注射BTC（0.5 μg/g體質(zhì)量）， 10 d后大鼠糖尿病狀態(tài)有所緩解， BTC治療組大鼠血
糖水平顯著低于對(duì)照組， 而血漿胰島素水平明顯高于非治療組， 持續(xù)時(shí)間長達(dá)4周， 治療30 d后病理學(xué)檢查證實(shí)BTC組大鼠胰島β細(xì)胞團(tuán)較對(duì)照組的大， 胰島樣細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目明顯增多， 糖耐量試驗(yàn)表明BTC治療的大鼠對(duì)糖刺激有很好的反應(yīng)性［8］; 用鏈脲霉素制成的糖尿病小鼠注射BTC
后， 也取得了同樣的效果［9］， Cho等［10］研究發(fā)現(xiàn)， BTC能促進(jìn)人類胚胎干細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞的分化由此可以推斷， BTC可能促進(jìn)了β細(xì)胞的增殖或者是促進(jìn)了胰腺干細(xì)胞增殖分化為β細(xì)胞， 分泌胰島素達(dá)到降低血糖的作用。
本研究中我們首先按照宋振順等的胰腺干細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)出大鼠胰腺干細(xì)胞， 并對(duì)其轉(zhuǎn)分化為胰島的情況做了初步研究。然后以該培養(yǎng)條件為對(duì)照， 在培養(yǎng)液中加入不同濃度的大鼠BTC， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 在20～30 mg/L的條件下大鼠β細(xì)胞素能有效促進(jìn)胰腺干細(xì)胞的增殖， 促進(jìn)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞， 為進(jìn)一步研究糖尿病疾病的病因， 發(fā)病機(jī)制， 預(yù)防及治療等提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在本研究中， 當(dāng)進(jìn)一步增加β細(xì)胞素的劑量后， 胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)受抑制的原因， 我們認(rèn)為是由于本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行β細(xì)胞素的分子克隆中， 我們的蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝存在局限性， 因此， β細(xì)胞素的制劑中可能存在較多的無機(jī)鹽或其他雜質(zhì)， 當(dāng)增加β細(xì)胞素的劑量后， 可能對(duì)胰腺干細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用， 在今后的工作中需要進(jìn)一步改善蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝， 提高β細(xì)胞素的純度。關(guān)于β細(xì)胞素在體外促進(jìn)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的分子機(jī)制， 目前尚不明確， 值得進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)
［1］Soria B， Skoudy A， Martin F. From stem cell to beta cells: new strategies in cell therapy of diabetes mellitus［J］. Diabetologia， 2001， 44(4): 407-415.
［2］Dunbar AJ， Goddard C. Structurefunction and biological role of betacellulin［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2000， 32(8): 805-815.
［3］Miura K， Doura H， Aizawa T， et al. Solution structure of betacellulin， a new member of EGFfamily ligands［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 294(5): 1040-1046.
［4］安家澤， 宋振順， 竇科峰， 等. 大鼠β細(xì)胞素蛋白的表達(dá)、 純化及生物學(xué)活性鑒定［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2005， 21(3): 284-286.
［5］宋振順， 顧克菊. 成人胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島細(xì)胞過程中的形態(tài)學(xué)觀察［J］. 外科理論與實(shí)踐， 2002， 7(3): 196-199.
［6］Gmyr V， Kerr2Conte J， Belaich S， et al. Adult human cytokeratin 19positive cells reexpress insulin promoter factor 1 in vitro: further evidence for pluripotent pancreatic stem cells in humans［J］. Diabetes， 2000， 49(10): 1671-1680.
［7］Li L， Seno M， Yamada H， et al. Promotion of betacell regeneration by betacellulin in ninety percentpancreatectomized rats［J］. Endocrinology， 2001， 142(12): 5379-5385.
篇(4)
關(guān)鍵詞：天然氣；催化燃燒；細(xì)胞；培養(yǎng)
中圖分類號(hào)：F407文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A
隨著我國大氣污染的日益嚴(yán)重，霧霾天氣區(qū)域性頻發(fā)，環(huán)境問題已變成當(dāng)前棘手的問題[1]。天然氣催化燃燒能從源頭上防治污染和保護(hù)生態(tài)環(huán)境，有助于形成低投入“低消耗”低排放和高效率的節(jié)約型增長方式，有利于對(duì)消耗高“污染重”技術(shù)落后的工藝和產(chǎn)品實(shí)施淘汰，降低污染物排放總量，加強(qiáng)資源綜合利用，加強(qiáng)污染防治[2]。
天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒能達(dá)到CO和NOx均小于5ppm的近零污染物排放，是一種節(jié)能環(huán)保的燃燒方式。天然氣燃燒溫度在1000℃以上，燃燒后的煙氣無菌潔凈[3-4]，對(duì)環(huán)境無污染，可將煙氣與空氣和CO2按照一定比例配比，配比后的氣體達(dá)到干細(xì)胞所需要的氣體成分，[5-7]，由于高溫?zé)煔馀c空氣和CO2混合的，所以混合后的氣體潔凈無菌[4]，可將其經(jīng)過過濾和降溫通入無菌箱或超凈工作臺(tái)使工作區(qū)域潔凈無菌，也可將氣體通入到CO2培養(yǎng)箱中，應(yīng)用到干細(xì)胞培養(yǎng)。
1.天然氣催化燃燒煙氣分析
中國計(jì)量科學(xué)研究院對(duì)天然氣催化燃燒煙氣檢測報(bào)告結(jié)果如表1所示：
表1 天然氣催化燃燒各組分氣體濃度
天然氣催化燃燒，燃料燃燒充分，并且其燃燒溫度在1100攝氏度左右，基本上全部轉(zhuǎn)為CO2和H2O，CO 和 NOx均小于5ppm，基本為零，由于天然氣中摻加極少量的H2S，燃燒產(chǎn)物為SO2和SO3，但其含量小于5ppm，幾乎為零，所以天然氣催化燃燒效率高，燃燒產(chǎn)物潔凈無菌，可將其用到無菌箱中。
2.干細(xì)胞培養(yǎng)所需氣體環(huán)境
除了滿足營養(yǎng)的需要以外，培養(yǎng)環(huán)境還必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性，包括溫度、氣相及PH等。
2.1溫度
體外培養(yǎng)的細(xì)胞需在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長，其適宜的溫度與取材的動(dòng)物種類有關(guān)。
2.2氣相及pH
體外培養(yǎng)細(xì)胞需要理想的氣體環(huán)境。包括O2及CO2，但其量則須恰當(dāng)。多數(shù)細(xì)胞需要在有O2條件下才能生長，氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài)，若O2分壓超過大氣中氧的含量可能對(duì)有些細(xì)胞有害。體外培養(yǎng)細(xì)胞采用開放培養(yǎng)時(shí)，其氣體環(huán)境一般應(yīng)為5%CO2＋95%空氣的混合氣體。大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2~7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6可能對(duì)細(xì)胞有害，甚至退變或死亡。
3.3 無污染及無毒
體外培養(yǎng)的細(xì)胞必須生長于無污染及無毒的環(huán)境。無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件 [5]。
3. 催化燃燒煙氣在細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用
無菌箱或超凈工作臺(tái)是細(xì)胞培養(yǎng)中要使用的，催化燃燒煙氣作為潔凈無毒無污染的煙氣可作為無菌氣體持續(xù)不斷地通入無菌箱，可使無菌箱持續(xù)保持無菌的狀態(tài)[4]，燃燒的煙氣與空氣、CO2按照一定比例混合后經(jīng)過過濾降溫通入無菌箱可以持續(xù)的保持無菌箱的無菌狀態(tài)，我們將在無菌箱中對(duì)細(xì)胞操作完之后，將處理后的細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱，傳統(tǒng)形式下需要一個(gè)5%的CO2瓶專門向CO2箱通入所需氣體，現(xiàn)在我們只需要將通入無菌箱的氣體通入CO2培養(yǎng)箱即可。
4. 實(shí)驗(yàn)裝置
天然氣催化燃燒V型爐煙氣分析系統(tǒng)如圖1所示，本次實(shí)驗(yàn)采用了兩塊獨(dú)石并排的催化燃燒V型燃燒器，所用獨(dú)石為堇青石蜂窩陶瓷，獨(dú)石內(nèi)表面上鍍著鈀（Pd）和銠（Rh）催化劑，獨(dú)石采用正方形截面尺寸為150mm×150mm，厚度為20mm，獨(dú)石孔道尺寸1mm×1mm，壁厚0.18mm，軟化溫度為1380℃。
圖1. 天然氣催化燃燒V型爐系統(tǒng)圖
反應(yīng)氣體天然氣和空氣分別通過量程為0~50 L/min 型號(hào)為GMS005 0BSRN200000的流量計(jì)和量程為0~80m3/h 型號(hào)為CMG400A080100000的空氣流量計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，這兩個(gè)有穩(wěn)流穩(wěn)壓器提供電流。在催化燃燒器點(diǎn)火前需要對(duì)燃燒器內(nèi)部的混合腔利用風(fēng)機(jī)進(jìn)行吹掃5 分鐘左右，來保證內(nèi)部無殘留的燃?xì)狻｜c(diǎn)火過程中，先將過量空氣系數(shù)調(diào)整到1.3左右進(jìn)行氣相燃燒從而達(dá)到預(yù)熱的目的，期間觀察催化劑獨(dú)石表面待表面火焰基本消失且內(nèi)部變?yōu)榧t色時(shí)，將空氣量調(diào)大使過量空氣系數(shù)達(dá)到2.0左右，此狀態(tài)為催化燃燒的穩(wěn)定燃燒狀態(tài)。此時(shí)，通過煙氣分析儀測量排放的煙氣，NO-NO2-NOx分析儀測量煙氣含量，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后進(jìn)行記錄。在箱體出口處插入熱電偶測量煙氣溫度。
5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
我們做了四組實(shí)驗(yàn)分別是燃?xì)饬髁繛?.1L/min 、7、8、9，相應(yīng)的空氣流量為7.3m3/h、7.8、9.2、10.3，對(duì)應(yīng)的空氣系數(shù)是2.09、1.94、2、2。圖2為記錄的煙氣成分CO、CO2、NOx濃度以及煙氣溫度。
圖2.不同燃?xì)饬髁肯聼煔飧鞒煞譂舛葓D 3.不同燃?xì)饬髁肯聼煔鉁囟?/p>
從圖2可以看出，NOx體積分?jǐn)?shù)都在1ppm以下，CO體積分?jǐn)?shù)在5ppm以下，接近于0，污染物含量極低，燃燒效果較好，CO2含量在5.7%上下，略高于細(xì)胞培養(yǎng)要求的5%，若將其應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)必須改變CO2含量。從圖3可以看出，排煙溫度在300℃以上，接近400℃，與細(xì)胞培養(yǎng)要求的37℃相差甚遠(yuǎn)，必須降溫。因此需要考慮將煙氣中通入某種氣體或者某幾種氣體將CO2和O2含量調(diào)節(jié)到細(xì)胞培養(yǎng)要求的含量。下面具體分析煙氣的主要成分。
5.2 天然氣組分說明
表 3-2 為通過氣相色譜儀所測得的實(shí)驗(yàn)過程中所使用的天然氣組分及各組分的體積含量。
表1.天然氣各組分體積分?jǐn)?shù)
5.21由于天然氣的主要成分是甲烷，所以天然氣燃燒的化學(xué)反應(yīng)方程式如下[8]：
實(shí)驗(yàn)用到的天然氣中甲烷占燃料總體積的 93%以上，所以實(shí)驗(yàn)中是以甲烷的不完全燃燒情況進(jìn)行了計(jì)算。所有含碳燃料在燃燒過程中都會(huì)產(chǎn)生CO這一中間產(chǎn)物。根據(jù)上述反應(yīng)方程式可知，反應(yīng)前后C原子個(gè)數(shù)是守恒的，反應(yīng)后CO和CO2的總體積與反應(yīng)前CH4的體積相等，即 。因?yàn)楹课⒑跗湮ⅲ梢院雎圆挥?jì)，所以可以認(rèn)為和燃燒前的含量相等，即；產(chǎn)生水蒸氣的量為，需要氧氣量，需要空氣量
煙氣總體積:
5.22 過量空氣系數(shù)為時(shí)，過量空氣相當(dāng)于多出未參加燃料反應(yīng)的那部分空氣產(chǎn)生的和水蒸氣的量不變，即，
過量空氣相當(dāng)于多出未參加燃料反應(yīng)的那部分空氣，煙氣中氧氣的體積:
煙氣的總體積：
干煙氣的總體積：
二氧化碳的體積分?jǐn)?shù):
氧氣的體積分?jǐn)?shù):
干煙氣中二氧化碳的體積分?jǐn)?shù):
氧氣的體積分?jǐn)?shù):
催化燃燒空氣的空氣系數(shù)是2，當(dāng)過量空氣系數(shù)為2時(shí)，帶入上式
二氧化碳體積分?jǐn)?shù)（煙氣中有水蒸氣）:
氧氣體積分?jǐn)?shù)（煙氣中有水蒸氣）:
二氧化碳體積分?jǐn)?shù)（煙氣中沒有水蒸氣）:
氧氣體積分?jǐn)?shù)（煙氣中沒有水蒸氣）:
5.23 煙氣分析儀使用塑料管將氣體通入分析儀分析煙氣成分，在管道中煙氣降溫到室溫，水蒸氣冷凝，所以可以近似認(rèn)為煙氣分析儀分析的氣體為干煙氣，數(shù)據(jù)計(jì)算CO2含量5.5%與實(shí)驗(yàn)相當(dāng)接近。
由于需要將煙氣中通氣體，雖然向濕煙氣中通氣體調(diào)節(jié)，但通入細(xì)胞培養(yǎng)儀器時(shí)的溫度為37℃，中間水蒸氣還會(huì)冷凝，所以調(diào)節(jié)氣體的體積分?jǐn)?shù)時(shí)仍然需要按照干煙氣的計(jì)算調(diào)節(jié)。
對(duì)比煙氣成分含量與要求的成分含量可以看出，需要降低CO2含量，提高氧氣含量。因?yàn)檠鯕馓岣叩铰缘陀?1%所以可以通入空氣，即能提高O2含量又能降低CO2。假定煙氣總體積為V，通入空氣體積為Vx，則CO2體積為5.541，O2為11.082。
通過計(jì)算通入空氣后CO2含量會(huì)低于要求的含量，因此還需通入CO2，通入CO2體積為VY
將，，，
解得，
當(dāng)煙氣的體積為V（不含水蒸氣）時(shí)，通入的燃?xì)饬繛?.0554V，空氣量為1.0554V，所以只要通入體積，燃?xì)饬浚嚎諝饬浚篊O2量=0.0554:155；0.0523=1:2797:0.944時(shí)，輸出的煙氣的成分即為，。
6. 結(jié)論
天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒煙氣潔凈無菌，將燃燒廢氣收集重新利用通入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)，此種方法使用即可以將煙氣充分利用，減少CO2排放，并且操作簡單，只需要向燃燒完的高溫?zé)煔庵型ㄈ攵康目諝夂虲O2即可，而且從通入氣體的比例來看，生成需要的氣體向煙氣中通入的空氣很多，通入的CO2確很少，比較經(jīng)濟(jì)，因此天然氣催化燃燒煙氣應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)是種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方式。
致謝
本資金由北京市供熱供燃?xì)馔L(fēng)及空調(diào)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，項(xiàng)目編號(hào)cxy2012019。
參考文獻(xiàn)
[1] 王淑蘭，柴發(fā)合，高健. 我國中長期PM2.5污染控制戰(zhàn)略及對(duì)策[J]. 環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展，2013，4：10-12
[2] 張世紅，Dupont Valerie，Williams Alan，Rickett Gavin. 硫化合物存在時(shí)天然氣催化燃燒機(jī)理與應(yīng)用[M]. 科學(xué)出版社，2010:1-2
[3] 李寧. 化燃燒冷凝鍋爐熱效率及節(jié)能特性研究[D]. 北京建筑工程學(xué)院碩士學(xué)位論文，2011.03：1-3
[4] L. F. Yan, M. Xiao, S. H. Zhang Exploration of exhaust gas of natural gas[A]. Advanced Materials Research Vols. 581-582, (2012) pp.1172-1175
[5] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)[M]. 世界圖書出版公司，2006:15-20
[6] 彭陽紅. 改良的氣體環(huán)境對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文，2008,05：2-4
篇(5)
據(jù)英國媒體報(bào)道，英國研究人員首次用3D打印機(jī)打印出胚胎干細(xì)胞，干細(xì)胞鮮活且保有發(fā)展為其他類型細(xì)胞的能力。我們知道，胚胎干細(xì)胞存在于胚胎發(fā)育早期的囊胚中，可發(fā)育為不同的細(xì)胞，是所有細(xì)胞最初期的形態(tài)。胚胎干細(xì)胞是萬能的，意味著它們可以發(fā)育成為身體內(nèi)200多種細(xì)胞類型中的任何一種。研究人員說，這種技術(shù)或可制造人體組織以測試藥物，制造器官，乃至直接在人體內(nèi)打印細(xì)胞。
胚胎干細(xì)胞3D打印機(jī)配備兩個(gè)“生物墨盒”，一個(gè)裝著浸在細(xì)胞培養(yǎng)基中的人體胚胎干細(xì)胞，另一個(gè)只有培養(yǎng)基。計(jì)算機(jī)控制微調(diào)閥噴出“墨水”，其速度可通過改變噴口直徑實(shí)現(xiàn)精確控制。
打印機(jī)上有顯微鏡，可以觀察細(xì)胞打印情況。兩種“墨水”一層一層間隔噴灑，形成不同濃度細(xì)胞飛沫，最小飛沫體積僅2納升，包含大約5個(gè)細(xì)胞。飛沫被噴入有諸多凹孔的培養(yǎng)皿中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，飛沫形成懸液，在各凹孔內(nèi)“抱成團(tuán)”。打印機(jī)可精確控制飛沫大小，使干細(xì)胞達(dá)到分化的最佳狀態(tài)。
研究人員在《生物制造》雜志說，檢測結(jié)果顯示，打印24小時(shí)后，95%以上細(xì)胞仍然存活，打印過程未殺死細(xì)胞；打印3天后，超過89%細(xì)胞存活，而且仍然維持多能性，即分化出多種細(xì)胞組織的潛能。
研究人員已經(jīng)用3D打印的干細(xì)胞制造出骨髓和皮膚。他們認(rèn)為，最終能借助這種方法制造器官，從而無需器官捐獻(xiàn)，同時(shí)還可以解決器官移植中的免疫抑制等問題。
篇(6)
[關(guān)鍵詞]毛囊干細(xì)胞；鑒定；分離培養(yǎng)
[中圖分類號(hào)]R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2015）19-0077-04
The cultivation and identification of hair follicle stem cells
XIAO Feng1，TAN Jun2
（Department of Plastic and Laser Aesthetic Surgery，People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）
Abstract： Hair follicle stem cells are the ideal seed cells for skin tissue engineering，which has become a hot research topic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author will analyze and summarize several methods of isolation and culture of hair follicle stem cells in recent years.It will provide a solid foundation for the further study of hair follicle stem cells.
Key words：hair follicle stem cells；identification；cultivation
干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，存在于胚胎及成體內(nèi)。在一定條件下，干細(xì)胞可以無限增殖而保持未分化狀態(tài)，也可以分化成多種功能細(xì)胞。20世紀(jì)，Cotsarelis、Taylor等[1]通過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊上部由外根鞘形成的明顯突起，即隆突區(qū)域也有干細(xì)胞的存在，這些干細(xì)胞被定義為毛囊干細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞與其他成體干細(xì)胞一樣擁有強(qiáng)大的增殖能力及多向分化潛能[2]。毛囊干細(xì)胞能通過自身的分裂增殖產(chǎn)生各種機(jī)體所需的細(xì)胞，以補(bǔ)充脫落和缺失的細(xì)胞；毛囊干細(xì)胞不僅能夠向下轉(zhuǎn)移到毛囊根部生成毛囊，而且還能從毛囊外根鞘向上遷移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年來，毛囊干細(xì)胞的研究備受關(guān)注，已成為研究熱點(diǎn)之一。目前，存在多種毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法，為毛囊干細(xì)胞的深入研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，作者就毛囊干細(xì)胞常用的分離培養(yǎng)及鑒定作一簡要綜述。
1 毛囊干細(xì)胞的分離純化
此前，已有許多研究者采用不同的方法來分離毛囊干細(xì)胞，并成功地進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)更深入的研究。目前對(duì)毛囊干細(xì)胞分離純化常用的有以下幾種方法：
1.1 組織塊培養(yǎng)法
取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用PBS液沖洗，將皮膚切成小塊，表皮朝上貼于加入適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法分離的干細(xì)胞能持續(xù)保持增殖趨勢，沒有明顯的平臺(tái)期，并且隨著不斷傳代純化，此方法獲得的毛囊干細(xì)胞純度明顯增加。但是組織塊培養(yǎng)法分離獲取毛囊干細(xì)胞的效率較低。史明艷等[5]使用該方法成功獲得毛囊干細(xì)胞，并分析指出該方法的優(yōu)勢在于組織塊培養(yǎng)時(shí)從組織塊中遷移出來其他細(xì)胞為毛囊干細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)類似于體內(nèi)的微環(huán)境，使毛囊干細(xì)胞能最大程度地保留增殖分化能力。
1.2 顯微分離技術(shù)
取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高濃度青、鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗3次；在超凈工作臺(tái)內(nèi)，顯微鏡下顯微鑷鈍性分離單個(gè)毛囊組織，收集形態(tài)完好且處于生長期的毛囊。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入含培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。顯微分離技術(shù)能從樣本直接選取毛囊干細(xì)胞相對(duì)富集區(qū)域，有利于后續(xù)進(jìn)一步的純化[6]。王祝遷等[7]使用此方法成功分離出大鼠毛囊干細(xì)胞，但單純應(yīng)用顯微分離技術(shù)獲取高純度的毛囊干細(xì)胞需花費(fèi)大量的時(shí)間和精力，效率偏低。
1.3 酶消化法
取含有待培養(yǎng)毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用含雙抗PBS液沖洗，將皮膚樣本剪成小塊，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃搖床消化2h。取出組織用PBS沖洗3遍，置于胰蛋白酶（質(zhì)量濃度為2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃搖床消化1h后，過200目鋼網(wǎng)。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。此方法獲得的毛囊干細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)，獲取效率高。鄭宣等[8]用此法獲得較純的毛囊干細(xì)胞，但獲得的毛囊干細(xì)胞經(jīng)歷增殖期后生長速度逐漸減慢，且細(xì)胞存活率下降，可能與酶消化法破壞了毛囊干細(xì)胞生長微環(huán)境有關(guān)。
1.4 差數(shù)貼壁法
將收集的細(xì)胞接種于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿中，靜置20min后，收集上層未貼附角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊真皮成纖維細(xì)胞于另一培養(yǎng)皿中，貼附皿底的毛囊干細(xì)胞，置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，每3d換液一次。與單純使用某種毛囊干細(xì)胞分離方法相比較，聯(lián)合差數(shù)貼壁法將更進(jìn)一步純化，獲得純度更高的毛囊干細(xì)胞。彭等[9]使用酶消化法聯(lián)合差數(shù)貼壁法獲得了形態(tài)典型且均勻一致的毛囊干細(xì)胞。目前此方法已被廣泛使用。
1.5 免疫磁珠法
免疫磁珠法主要用來純化分離培養(yǎng)獲得的毛囊隆突區(qū)細(xì)胞中某種標(biāo)記物陽性的細(xì)胞。首先制作細(xì)胞懸液，并加入FITC標(biāo)記的某種標(biāo)記物單抗，室溫孵育30min，離心后棄上清中未結(jié)合的抗體，加入磁珠分選緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心后棄上清，PBS緩沖液清洗2次，取重懸后細(xì)胞與免疫磁珠混合，室溫反應(yīng)30min。磁珠分離器分離8min，去除未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞。將結(jié)合了靶細(xì)胞的免疫磁珠用磁珠分選緩沖液洗5次。體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)48h，使細(xì)胞與磁珠分離，即可獲得較純的毛囊干細(xì)胞。譚挺等[10]用此法獲得高純度毛囊干細(xì)胞，他們指出此方法與顯微分離技術(shù)連用有單次操作分離細(xì)胞數(shù)量大且純度較高、能與細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡等分子生物學(xué)技術(shù)兼容等特點(diǎn)。黃恩毅等[11]用此法有效分離并成功培養(yǎng)CD34+毛囊干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)分選后的細(xì)胞仍具有較好的活性，且增殖速度快，增殖期長。盧葳等[6]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，免疫磁珠分選后毛囊干細(xì)胞活力較好，分離獲得的毛囊干細(xì)胞適合用于細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)等后續(xù)試驗(yàn)。
1.6 流式細(xì)胞儀分選法
通過毛囊干細(xì)胞表達(dá)的某些特異性標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀可以將目的活細(xì)胞從異質(zhì)性細(xì)胞群中分離出來，獲得較高純度的特異性細(xì)胞。常用的是熒光激活細(xì)胞分選器。盧葳等[6]使用流式細(xì)胞儀分選CD34+毛囊干細(xì)胞，獲得的毛囊干細(xì)胞純度很高、污染機(jī)會(huì)小，但是分選過程費(fèi)時(shí)，細(xì)胞分選后活力稍差。此方法適合于需要做免疫組化，蛋白質(zhì)組織學(xué)等對(duì)細(xì)胞純度要求高的實(shí)驗(yàn)。
2 毛囊干細(xì)胞的鑒定
干細(xì)胞的鑒定一直是干細(xì)胞研究的難點(diǎn)，常用干細(xì)胞的標(biāo)記物輔助方法進(jìn)行鑒定。毛囊干細(xì)胞有多種明確的分子標(biāo)記物，如CD34、K15、K19 [12]。
2.1 角蛋白家族
角蛋白是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于生物體的組織結(jié)構(gòu)中。在表皮細(xì)胞中，它們以微絲的狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)形成廣泛的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在上皮組織中有20多種不同種類的角蛋白表達(dá)。在表皮細(xì)胞中，隨著分化程度的不同其所表達(dá)的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作為毛囊干細(xì)胞的鑒定手段。1998年，lyle等[13]通過表達(dá)克隆發(fā)現(xiàn)K15是毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記之一，此后K15一直被當(dāng)做較為公認(rèn)的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物。20世紀(jì)末，有研究者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滯留細(xì)胞所在的毛囊隆突部細(xì)強(qiáng)表達(dá)K19[14]；同時(shí)有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛囊隆突部K19高表達(dá)細(xì)胞缺乏特異性分化標(biāo)志，進(jìn)一步證實(shí) K19高表達(dá)細(xì)胞為毛囊干細(xì)胞，因此，認(rèn)為K19也可作為毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記物[15]。在毛囊干細(xì)胞分化過程中，K15表達(dá)減弱較K19早，K19表達(dá)陽性而K15陰性的細(xì)胞仍有可能為處于早期階段的增殖細(xì)胞，因此推測，檢測毛囊干細(xì)胞時(shí)K15更準(zhǔn)確[13]。
2.2 鈣黏蛋白家族
鈣黏蛋白是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的細(xì)胞黏著糖蛋白，對(duì)胚胎發(fā)育中的細(xì)胞識(shí)別、遷移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。不同細(xì)胞及發(fā)育不同階段其細(xì)胞表面的鈣黏蛋白的種類與數(shù)量均有所不同，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十種鈣黏蛋白。CD34抗原是鈣黏蛋白中的一種，是一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，為階段特異性白細(xì)胞分化抗原，CD34表達(dá)于人類造血干細(xì)胞，CD34是目前公認(rèn)的造血干細(xì)胞標(biāo)志物。Ohyama等[16]通過對(duì)鼠毛囊的研究，發(fā)現(xiàn)鼠毛囊中CD34陽性細(xì)胞與毛囊隆突部滯留細(xì)胞和K15陽性細(xì)胞在毛囊處位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物。Trempus等[17]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了CD34表達(dá)于小鼠毛囊干細(xì)胞。但CD34在人毛囊干細(xì)胞不表達(dá)，Shu Jiang等[18] 通過對(duì)人頭皮進(jìn)行原位免疫組化和多色免疫熒光標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)CD34特異性表達(dá)于毛囊間表皮基底部。
2.3 整合素家族
整合素是機(jī)體重要的黏附分子，是廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞表面的一類細(xì)胞跨膜蛋白，在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間及細(xì)胞與細(xì)胞間起黏附作用，整合素是由α和β兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，它們按不同的組合構(gòu)成20余種整合素。目前，整合素也被廣泛用于毛囊干細(xì)胞的鑒定，常用的整合素為整合素β1。1995年，Jones等[19]根據(jù)表皮細(xì)胞表達(dá)整合素β1的水平將其進(jìn)行分組培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達(dá)的表皮細(xì)胞比低表達(dá)者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Watt等[20]發(fā)現(xiàn)，富含整合素β1的皮膚基底細(xì)胞比整合素β1含量少的皮膚基底細(xì)胞能更快速的黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述發(fā)現(xiàn)均為整合素β1作為毛囊干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物提供有力支持。
3 結(jié)論
綜上，目前常用的分離培養(yǎng)方法主要包括：組織塊培養(yǎng)法、顯微分離技術(shù)、酶消化法、差數(shù)貼壁法、免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀分選法，每種方法均有各自的優(yōu)勢及缺陷；組織塊培養(yǎng)法簡單，但是分離純度不高，分離效率低下；顯微分離技術(shù)相對(duì)其他方法而言，分離純度高，但是分離過程比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力；酶消化法效率高，但是酶消化過程同時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞微環(huán)境，影響細(xì)胞存活率；差數(shù)貼壁法一般聯(lián)合其他分離純化方法，能進(jìn)一步純化所獲毛囊干細(xì)胞；免疫磁珠法獲得的毛囊干細(xì)胞純度高、活性強(qiáng)，但是分離方法較復(fù)雜；流式細(xì)胞儀分選法所獲得毛囊干細(xì)胞純度高，但細(xì)胞活性低。因此，在選擇毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法時(shí)一定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特殊要求及實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的方法。毛囊干細(xì)胞的鑒定方法常用的包括：角蛋白家族、鈣黏蛋白家族、整合素家族；實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，同時(shí)檢測兩種以上的標(biāo)記物來鑒定毛囊干細(xì)胞是較為準(zhǔn)確的一種方法。
毛囊干細(xì)胞具有其他干細(xì)胞的共同特征，具有多向分化潛能。目前，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)毛囊干細(xì)胞能用于尿道缺損、神經(jīng)損傷的修復(fù)；能夠分化成為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞[1，21-22]；能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合，將其作為工程皮膚中的種子細(xì)胞，有利于表皮細(xì)胞及汗腺、毛囊等附屬器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干細(xì)胞有利于瘢痕的修復(fù)，但該研究仍處于起步階段，相信經(jīng)過研究者們的不懈努力，其必將為瘢痕治療這一世界性難題提供一種有效的新方法。
[參考文獻(xiàn)]
[1]趙奎，賈宗菲，弓慧敏，等.毛囊干細(xì)胞的分離方法及應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：82-85.
[2]Wu JC，Yang TT，Xu X，et al.Research on differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes invitro[J].J Med Postgra，2010，23（2）：128-132.
[3]原璐，王春生，安鐵洙，等.毛囊干細(xì)胞研究進(jìn)展[J].中國生物雜志，2009，29（1）：75-79.
[4]Jaks V，Barker N，Kasper M，et al.Igr5 marks cycling， yet long-lived，hair follicle stem cells[J].Nat Genet，2008，40（11）：1291-1299.
[5]史明艷，楊學(xué)義，竇忠英.山羊毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（5）：436-440.
[6]盧葳，陳瑾，李惠.兩種純化大鼠毛囊干細(xì)胞方法的比較[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35（1）：124-126.
[7]王祝遷，木拉提?熱夏提，李佳，等.大鼠觸須毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（27）：5031-5034.
[8]鄭宣，許世超，全仁夫.大鼠毛囊干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及相關(guān)檢測的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2014，22（2）：8-14.
[9]彭，王玉杰，李佳，等.不同體積分?jǐn)?shù)富血小板血漿與大鼠毛囊干細(xì)胞的增殖[J]. 中國組織工程研究，2012，16（45）：8501-8505.
[10]譚挺，胡志奇，周洪軍.顯微分離培養(yǎng)與免疫磁珠法分離純化人毛囊干細(xì)胞[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2008，22（2）：202-205.
[11]黃恩毅，楊恬，陳偉，等.毛囊干細(xì)胞的純化培養(yǎng)鑒定及其生物學(xué)特性[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（1）：39-42.
[12]Tsai SY，Clavel C，Kim S，et al.Oct4 and klf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells[J].Stem Cells，2010，28（2）：221-228.
[13]Lyle S，Christofidou-Solomidou M，Iiu Y，et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the 10- 8 cation of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci，1998，111：3179-3188.
[14]Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro： keratin 19 expressing cells are differentially 10 calized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage[J].J Cell Sci，1996，109：1017-1028.
[15]Reynolds AJ，Jahoda CA.Hair follicle stem cells A distinct germinative epidermal cell population is active in vitro by the presence of hair dermal papillar cells[J].J Cell Sci，1991，99：373-385.
[16]Ohyama M，Terunuma A，Tock CL，et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].J Clin Invest，2006，116（1）：249- 260.
[17]Trempus CS，Morris RJ，Bortner CD，et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34[J].J Invest Dermatol，2003，120（4）：501-511.
[18]Shu Jiang，Longmei Zhao，Bhamini Purandare，et al. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments[J]. Histochem Cell Biol， 2010，133：455-465.
[19]Jones PH，Harper S，Watt FM. Stem cell patterning and fate in human epidermis[J].Cell，1995，80（1）：83-93.
[20]Watt FM.Epidermal stem cells：markers，patterning and the control of stem cell fate[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1998，353（1370）：831-837.
[21]蔡霞.人毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定與生物學(xué)特性的初步研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2014，35（1）：1-3.
篇(7)
目的： 利用簡化無血清培養(yǎng)基和連續(xù)傳代法，從成體小鼠腸管分離培養(yǎng)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞(GNCSCs)，觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中增殖、分化的特點(diǎn). 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作為特異性標(biāo)志來鑒定GNCSCs及其分化的細(xì)胞系. 方法： 將新生1， 5 d的小鼠腸管制成單細(xì)胞懸液，接種于無血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，觀察其分化現(xiàn)象. 用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測克隆球及其分化細(xì)胞系特異性標(biāo)志物的表達(dá). 結(jié)果： 成體小鼠腸管中有少數(shù)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞. 結(jié)論： 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)所必須的細(xì)胞類型.
【關(guān)鍵詞】 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞 小鼠 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞分化 Hirschsprung病
0引言
應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病，經(jīng)過較長時(shí)間的實(shí)踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細(xì)胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)著重進(jìn)行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).
1材料和方法
1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. ① DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).
1.2方法
1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機(jī)械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)先配置的無血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以 6×108個(gè)/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng). 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細(xì)胞，以2/3量換液，孵育3 d后進(jìn)行傳代，以6×108個(gè)/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48 h后再次傳代，如有細(xì)胞團(tuán)塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.
1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL，動(dòng)態(tài)觀察克隆球的分化情況.
1.2.3克隆球及其分化細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色應(yīng)用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細(xì)胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.
轉(zhuǎn)貼于
2結(jié)果
2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細(xì)胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán). 孵育24 h后，貼壁細(xì)胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細(xì)胞胞體增大，折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)分裂相，形成2～5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數(shù)十個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時(shí)向周圍伸出放射狀的細(xì)胞索，形成較小的次級(jí)克隆，這些克隆球形態(tài)完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu) （圖1B）. 重新傳代培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞胞體增大，出現(xiàn)分裂相的克隆球數(shù)量逐漸增多，雜質(zhì)細(xì)胞減少，在連續(xù)傳代過程中克隆球逐漸純化.
2.2克隆球的分化接種含血清培養(yǎng)基12 h后，可見有細(xì)胞從克隆球中遷出，遷出的細(xì)胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細(xì)胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態(tài)；48 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，逐漸形成單細(xì)胞層且細(xì)胞形態(tài)多元化.
2.3克隆球及其分化細(xì)胞系的免疫染色免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.
3討論
許多研究表明GNCSCs在ENS的發(fā)生和發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關(guān)［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發(fā)生障礙，受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)缺失，表明先天性巨結(jié)腸可能是一種干細(xì)胞疾病. 由于HSCR及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞性疾病在手術(shù)治療后仍遺留有嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此用干細(xì)胞來進(jìn)行臨床治療已成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn). 鑒于胚胎干細(xì)胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗(yàn)提供新契機(jī).
GNCSCs的培養(yǎng)方法建立在中樞神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上. 依據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)典的培養(yǎng)方法，再結(jié)合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用簡化的特殊培養(yǎng)劑和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng). 連續(xù)傳10代后，GNCSCs的相對(duì)比例明顯增加，這種體外培養(yǎng)的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細(xì)胞. 如果繼續(xù)傳代，其純化程度越高，后續(xù)的試驗(yàn)效果將更佳. 連續(xù)傳代不僅純化了GNCSCs，還證實(shí)了干細(xì)胞的自我更新特性. 在體外培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)條件稍有變化可導(dǎo)致分化機(jī)制的啟動(dòng)，因此采用血清促分化法誘導(dǎo)GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實(shí)了GNCSCs分化細(xì)胞的類型，同時(shí)顯示了分化的亞型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，并表明了成體干細(xì)胞的多向分化能力.
參考文獻(xiàn)
［1］ 楊帆，楊樹源. 神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)綜述， 2002；8(8):491-493.
［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.
［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.